表皮卫士 StaphDress

                                    工程化表皮葡萄球菌的智能护肤霜治疗老年湿疹

Murphy's code     

1. 项目介绍

1.1 临床负担：老年湿疹的医疗需求

流行病学和疾病负担

在我国老龄化社会中，老年人湿疹是一个重大且日益严重的公共卫生挑战。在全球人口老龄化的背景下，老年人口将快速上升，中国65岁及以上老年人口目前已超过2亿，2050年或将超过4亿[1]。中国老年AD的发病率、患病率和伤残调整寿命年均位居世界首列，面临及其严重的疾病负担（如图）。虽然AD在儿童时期就较为常见，其影响可能持续到成年期，但是老年AD更多见于老年期发病[2]。与主要影响儿童和年轻人的特应性皮炎不同，老年湿疹是在发生深刻生理变化的背景下出现的：进行性皮肤屏障变性、免疫衰老和神经感觉知觉改变，这创造了一种独特的复杂治疗前景。

图1：全球老年湿疹发病率、患病率和伤残调整寿命年分布图[1]

图2：湿疹的临床表现与症状

老年湿疹的临床表现为广泛的干燥（皮肤干燥）、苔藓样斑块和顽固性瘙痒，严重影响睡眠质量和心理健康。在这一人群中，"瘙痒-抓挠循环"变得尤其具有破坏性：与年龄相关的皮肤变薄和胶原丢失使表皮容易受到抓挠带来的机械损伤，从而导致刮伤、继发感染和进一步屏障受损[3]。

当前治疗方法的局限性

老年湿疹的现有治疗方法面临巨大局限性，导致患者得不到充分治疗：

治疗方法 主要局限性
外用糖皮质激素 皮肤萎缩、毛细血管扩张和伤口愈合受损更容易发生，恢复更慢；过度使用导致红皮病的风险[4]
外用钙调神经磷酸酶抑制剂 常见烧灼感和刺痛感；免疫衰老背景下的疗效降低；成本高而依从性低[5]
全身性抗生素 不加选择地消灭共生微生物群；抗微生物药物产生耐药性；未能解决皮肤表面微生态失衡[6]
系统性免疫抑制剂 因肾/肝损害、心血管风险以及与常见老年药物的药物相互作用禁忌[7]
生物制剂（dupilumab, nemolizumab） 需要皮下给药；费用负担沉重；75岁以上患者的疗效有限，超过半数的患者尽管接受了治疗仍有持续的疾病活动[8]

近年来，正在兴起的共生菌疗法为人们指出一条治疗AD的新思路。皮肤表面的共生菌可以通过释放AMP等抑菌物质，降低金黄色葡萄球菌等病原菌在皮肤表面的定植[9]。研究人员将AD患者正常部位分离出来的CoNS经过培养，应用在其自身皮肤病变部位，发现皮肤表面定植的金黄色葡萄球菌的丰度明显下降，患者的病情也得到明显的改善[10]。将人葡萄球菌A9(Staphylococcus hominis A9, ShA9)应用于治疗AD患者的皮肤病变部位，经过7d、每日2次的局部应用后发现病变部位金黄色葡萄球菌的分离率明显减少，且无严重不良反应，为共生菌活菌治疗的安全性提供了直接证据[11]。从健康人皮肤分离出的黏液玫瑰单胞菌(Roseomonas mucosa, RM)局部应用于AD患者皮肤病变部位，经过每周2次、持续4个月的治疗后发现患者疾病评分有十分显著的改善[12]。这些研究结果提示维持局部微生态平衡在缓解AD疾病过程中发挥疗效。这推动了我们以工程益生菌维持微生态平衡为中心的治疗方法。

1.2 维持微生态平衡：从病原体杀灭到生态恢复

皮肤微生物群功能的三大支柱

皮肤微生物群（包括细菌、真菌、病毒及其集体遗传物质）形成了对皮肤健康至关重要的复杂生态系统[13]。这个生态系统执行三个相互依赖的功能：

  1. 屏障保护：共生微生物与病原体竞争营养物质和粘附位点，产生抗菌分子（细菌素、短链脂肪酸、蛋白酶），并维持抑制病原体生长的酸性皮肤pH值。表皮葡萄球菌通过分泌酚溶性调节素（psm）和丝氨酸蛋白酶（Esp）体现了这些功能，它们选择性地抑制金黄色葡萄球菌，同时耐受共生菌[14]。
  2. 免疫调节：皮肤共生菌可调节固有免疫和适应性免疫，促进抗菌肽（β-防御素，RNase7）的产生，诱导调节性t细胞（Treg）的发育，并维持免疫耐受[15]。生命早期适当的共生菌定植可建立长期的免疫稳态；这一过程的破坏会导致炎症性皮肤病。
  3. 代谢相互作用：微生物代谢物直接影响皮肤生理。表皮葡萄球菌的鞘磷脂酶活性产生对屏障完整性至关重要的神经酰胺；短链脂肪酸调节角质形成细胞分化和炎症反应[16]。

图3：皮肤微生物群与免疫细胞的相互作用[13]

图4：健康皮肤、非发作期特应性皮炎和发作期特应性皮炎的皮肤微生物群变化[17]

金黄色葡萄球菌：湿疹发病机制中的表皮失衡

在健康皮肤中，表皮葡萄球菌在细菌群落中占主导地位，通过多种机制维持生态稳定性。在湿疹中，这种平衡被破坏：金黄色葡萄球菌定植率在病变皮肤中达到90%，细菌密度为10⁶-10⁷CFU/cm²，而健康皮肤的细菌密度为<10³CFU/cm²[18]。这种过度生长不仅是继发性感染，而且积极推动了疾病的发病机制：

重要的是，最近的研究表明，金黄色葡萄球菌通过独立于炎症的神经免疫机制直接导致瘙痒：细菌丝氨酸蛋白酶V8激活感觉神经元上的蛋白酶激活受体1(PAR1)，触发绕过传统炎症途径的瘙痒信号[20]。这一发现解释了为什么单独的抗炎疗法往往不能充分控制瘙痒，并激发了我们的双靶点止痒策略。

工程益生菌维持微生态平衡疗法

共生菌疗法具有显著优势：能够减少抗微生物药物耐药性的产生，通过生态恢复降低复发率，并改善宿主与微生物之间的代谢相互作用。然而，目前的方法面临着严重的局限性：

方法 限制
植入益生菌 非定居菌株的定植不良；缺乏靶向功能性递送；无法克服已确立的病原体优势
服用益生菌 缺乏动态代谢活性和生态竞争；功效有限
维持体内菌群平衡 品种间存在差异；缺乏可编程控制；治疗强度不足

工程化益生菌提供了解决方案——工程活体生物治疗产品（engineered Live Biotherapeutic Products, eLBPs）将经过基因工程改造的益生菌作为"活的药物工厂"，在宿主体内持续产生并递送治疗性分子[21]。相较于传统的蛋白质药物或化学小分子，单细胞工程微生物作为治疗载体展现出多维度的独特优势：

  1. 工程微生物能够实现治疗蛋白的原位持续分泌，从根本上规避了外源蛋白透皮吸收效率低下、全身给药靶向性不足以及反复注射带来的患者依从性问题。
  2. 细菌表达系统生长迅速、培养条件简单，且工程菌株可直接作为终产品的一部分，省去了蛋白质纯化、制剂开发等关键环节。
  3. 工程微生物具备环境响应与智能调控的潜力，能感知局部微环境信号（如pH变化、炎症因子浓度、特定代谢产物水平），并据此动态调整治疗蛋白的表达与分泌。

通过对益生菌的改造，使其既具备益生菌治疗的广谱性，又具备工程菌治疗的靶向性（如图）。

图5：皮肤微生物组干预策略——从非靶向到靶向的方法[22]

近年来，皮肤的工程活体生物治疗产品不断取得进展，已建立起较为完善的分子生物学工具箱，涵盖基因敲除、基因过表达、报告基因融合、以及复杂的合成生物学回路构建。例如，研究人员成功编辑 C. acnes 使其在小鼠皮肤上表达和分泌中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL），从而促进皮脂细胞凋亡，缓解痤疮症状[23]。这为我们的方案提供了技术支撑。

1.3 我们的方案：StaphDress——表皮益生菌护肤霜

我们提出StaphDress——基于工程表皮葡萄球菌配制局部护肤霜治疗老年人湿疹。StaphDress将五个功能模块整合到一个统一的治疗系统中，专门针对老年湿疹的特点设计（如图）：

图6：EpiGuard项目海报——三重作用合成生物学治疗靶向微生物组-免疫-屏障功能障碍

模块 功能 核心设计 针对老年湿疹
模块I 智能响应杀菌模块 利用病原体自身AIP通讯信号的密度依赖性激活；Esp蛋白酶选择性破坏金黄色葡萄球菌生物膜 保持共生菌群多样性；避免微生态破坏
模块II 神经免疫调控止痒模块 抗IL -31 scFV抗体阻断瘙痒；PAR1拮抗肽中和V8蛋白酶阻断神经元激活 治疗老年人突出的慢性炎症性和急性神经性瘙痒
模块III 微环境酸化和屏障修复模块 增强乳酸生成可促进神经酰胺合成并减少经皮水分流失 改善与年龄相关的屏障退化
模块IV 温度控制自杀模块 核心体温下FourU 分子热敏拉链融化，启动MazF 毒素自杀；不需要化学诱导剂 室温储存，提高老年患者的依从性
模块V 代谢营养缺陷模块 Δalr-D-丙氨酸依赖确保了"产品即容器"的安全性 易理解的安全设计，提高老年患者的依从性

1.4 项目愿景和影响

短期目标

更广泛的影响

StaphDress代表了"生态医学"的概念验证，这是一种利用而不是对抗宿主-微生物关系的治疗策略。在抗微生物药物耐药性危机时代，在恢复微生物平衡的同时减少抗生素依赖的方法为管理感染性和炎性疾病提供了可持续的前进道路。对于全球不断增长的老年人口，成功开发出这些方法将提供安全、有效、可及且有尊严的湿疹管理，从而减少痛苦、保持独立性并减少医疗利用率。

图7：手部湿疹的艺术表现——对患者的关怀与治疗希望

2. 项目设计

在老年人湿疹皮肤生态系统中，共生菌与病原菌之间存在着持续的"领地争夺战"。表皮葡萄球菌作为皮肤屏障的原生卫士，面临着金黄色葡萄球菌的侵略性扩张——后者通过群体感应系统协调攻击，建立生物膜堡垒，并释放毒素破坏皮肤屏障。随着抗生素耐药性危机的加剧和老年患者免疫衰老的复杂性，传统的"无差别火力覆盖"（广谱抗生素）已陷入"滥杀无辜"（破坏微生态）与"火力不足"（诱导耐药）的双重困境。就像现代安防系统中智能哨兵取代无差别武器一样，我们运用合成生物学方法将表皮葡萄球菌改造为"表皮卫士"（StaphDress）——一位配备多重感官、智能判断能力且具备自我约束机制的生态守护者，专门守护老年患者脆弱的皮肤微环境。

  1. 精准敌我识别能力。 优秀的卫士必须具备高度的辨别力，能够准确区分友军与入侵者。金黄色葡萄球菌通过agr群体感应系统分泌AIP信号分子来协调毒力因子的释放，这如同敌军的秘密通讯暗号。我们在表皮葡萄球菌中植入AgrC-AgrA双组分感应系统（Module I），使其能够特异性"监听"敌军信号（AIP达到阈值浓度启动相应）。就像智能安防系统通过声纹识别锁定特定入侵者，工程菌仅在金黄色葡萄球菌建立优势定植、释放足够AIP信号时才激活防御程序，确保对正常皮肤共生菌群的"零误伤"，维持微生态的多样性。
  2. 复合感官警戒系统。 老年湿疹的病理机制具有"双重战线"特征：既有金黄色葡萄球菌过度增殖导致的炎症，又有细菌蛋白酶V8和细胞因子IL-31直接激活感觉神经元引发的顽固性瘙痒。单一感官的卫士往往顾此失彼。我们设计双模态复合警戒：一方面通过Esp丝氨酸蛋白酶（Module I）作为"生物传感器+效应器"，精准识别并降解金黄色葡萄球菌生物膜蛋白，瓦解其防御工事；另一方面同时分泌抗IL-31 scFV抗体和PAR1拮抗肽（Module II），分别监控并中和IL-31受体介导的炎症瘙痒和V8蛋白酶-PAR1通路介导的神经性瘙痒。这种"抗菌+止痒"的复合感官网络，如同卫士配备红外与雷达双模监控，实现对威胁不同维度的同步感知与响应。
  3. 释放特异性防御武器。 当卫士确认入侵者后，会启动模块化武器库而非无差别攻击：Esp蛋白酶作为"精准捕网"，特异性缠绕并分解金黄色葡萄球菌生物膜基质而不损伤宿主细胞；抗IL-31 scFV抗体融合TAT穿膜肽，如同"袖珍干扰器"穿透角质层，中和致痒细胞因子；PAR1拮抗肽则作为"化学中和剂"，形成共价复合物不可逆地抑制V8蛋白酶活性。相较于传统抗生素的"焦土策略"，这种选择性清除与精准中和最大限度保护了皮肤微生态中的"平民"（有益共生菌），实现了"精准执法"。
  4. 防止卫士自身的失控风险。 再强大的卫士若失去控制，本身也可能成为威胁。活的工程菌若进入血液或环境，可能引发不可预见的生态风险或基因水平转移。我们构建了双重自我约束机制：温控退役系统（Module IV）配备分子温度保险，利用 Pldh1-FourU-MazF 三层级精密控释架构，在皮肤温度下通过 FourU 分子拉链折叠隐藏 RBS，阻断 MazF 毒素翻译，确保工程菌正常执勤；一旦误侵入核心体温环境，热敏拉链熔化解锁，同时 Pldh1 响应微环境应激（Rex 蛋白脱落）激活转录，快速释放 MazF 毒素切割胞内 mRNA，完成细菌自我清除；代谢营养缺陷（Module V）则通过敲除丙氨酸消旋酶（Δalr），使工程菌成为"D-丙氨酸依赖型"，离开含D-丙氨酸的护肤霜"供给站"即停止生长。这如同为卫士配备"电子围栏"与"燃料限制器"，双重保险防止"哨兵"越界或叛乱。
  5. 主动退役与战场清理机制。 不同于永久驻留可能造成生态负担的传统疗法，我们的工程菌具备环境响应性任务终止能力。通过过表达乳酸脱氢酶（Module III），工程菌持续分泌乳酸，在完成任务后自然降低局部pH至4.5-5.5，既抑制嗜中性pH的金黄色葡萄球菌增殖，又激活宿主酸性鞘磷脂酶促进神经酰胺合成，修复皮肤屏障——如同卫士在驱逐入侵者后主动修复城墙。同时，温度与营养的双重开关构成了可逆的召回机制，确保当患者身体状况变化或治疗需要终止时，卫士能够及时"卸甲归田"，不遗留安全隐患。
  6. 可模块化升级的防御装备。金黄色葡萄球菌存在I-IV种不同的AIP通讯亚型，且不同患者可能合并其他病原菌感染。我们的系统采用标准化装备接口：AgrC感应模块可通过定向进化改变AIP结合特异性，适配不同地域流行的菌株类型；效应器模块支持"即插即用"替换——无论是升级更高效的Esp变体，还是针对其他瘙痒介质的纳米抗体，均可通过质粒骨架快速重组。这种模块化架构使"表皮卫士"如同可换装不同防暴装备的安保单元，具备应对复杂安全局势的灵活性与持续进化能力。

为什么选择有益人类皮肤共生菌？

选择有益人类皮肤共生菌作为工程菌宿主，是基于其皮肤常驻共生菌的天然适应性优势和多重益生功能的综合考量。以表皮葡萄球菌为例，与大肠杆菌、乳酸菌等外来菌株相比，其具有无可比拟的皮肤生态位竞争优势。

  1. 天然适应性优势源于长期共进化形成的生理特化。表皮葡萄球菌占据健康皮肤菌群的主导地位（10⁴-10⁶ CFU/cm²），其基因组编码完整的皮肤环境适应系统：耐盐、耐干燥、耐弱酸的应激响应机制使其能够在高渗、低水活度环境中长期存活；高效的皮脂利用能力通过脂肪酶分解甘油三酯获取碳源，确保营养竞争优势；适度的生物膜形成实现稳定定植而不引发过度炎症。
  2. 内在病原菌抑制机制为工程化改造提供了天然功能模板。表皮葡萄球菌通过多重机制竞争性排斥金黄色葡萄球菌：
抑制机制 分子基础 效应特征
营养竞争 皮脂利用（lip基因簇）、铁载体（sbn操纵子）获取 限制金黄色葡萄球菌生长必需资源
抗菌肽分泌 PSMγ、PSMδ、Epidermin等酚溶性调节素 直接杀伤或抑制竞争菌株
丝氨酸蛋白酶Esp 降解金黄色葡萄球菌生物膜蛋白Aap、SasG 破坏定植能力，体内验证有效
群体感应干扰 抑制金黄色葡萄球菌agr系统功能 阻断毒力因子协调表达
免疫调节激活 TLR2信号诱导β-防御素-3、IL-10产生 增强宿主屏障免疫，促进耐受

尤为重要的是，Esp的发现为智能杀菌模块提供了理想效应分子。Iwase等证明，分泌Esp的表皮葡萄球菌菌株可完全消除小鼠鼻腔的金黄色葡萄球菌定植，且流行病学数据显示人类鼻腔中Esp+表皮葡萄球菌与金黄色葡萄球菌缺失显著相关[24]。Esp通过特异性降解金黄色葡萄球菌生物膜相关蛋白（Aap、SasG、FnBPA等）发挥作用，而对表皮葡萄球菌自身生物膜蛋白的最小交叉反应已通过结构生物学研究证实。

  1. 代谢互作功能直接促进宿主皮肤健康。表皮葡萄球菌发酵皮脂和甘油产生乳酸、乙酸、琥珀酸等短链脂肪酸，维持皮肤表面pH 4.5-5.5的弱酸性环境，这一酸性环境对金黄色葡萄球菌生长具有显著抑制作用（其最适pH为7.0-7.5）[25]。研究表明，在pH 4.7的乳酸缓冲液中，表皮葡萄球菌生长活力增强而金黄色葡萄球菌受抑；将前臂皮肤酸化至pH 4.0后，分离细菌数仅为24 CFU且金黄色葡萄球菌占比极低。此外，表皮葡萄球菌分泌的鞘磷脂酶可促进角质层神经酰胺生成，加固角质细胞间的脂质连接，直接针对老年湿疹的屏障功能障碍。
  2. 安全性基础方面，表皮葡萄球菌作为凝固酶阴性葡萄球菌（CoNS），其致病性远低于金黄色葡萄球菌等凝固酶阳性菌株。临床分离株通常不携带金黄色葡萄球菌特有的毒力因子（α-毒素、PVL、TSST-1等），且对多种抗生素保持敏感。经过基因组筛选排除生物膜过度形成能力和潜在毒力因子的菌株，可作为安全的工程化改造起点。

为什么选择护肤霜剂型？

护肤霜剂型通过高封闭性保湿（对抗老年皮肤干燥）、弱酸性pH适配（抑制病原菌+修复屏障）和活菌-营养缓释系统（实现D-丙氨酸生物遏制）的三重机制，成为"表皮卫士"工程菌符合临床需求的最佳递送载体。凝胶因低封闭性、中性pH限制及营养因子封装能力不足，无法满足项目的技术与安全要求。循证医学与药剂学证据，护肤霜（Cream/Ointment）是"表皮卫士"（StaphDress）工程菌递送的最优载体。

1. 微生态友好性载体系统：活菌包埋与选择性抑制

霜剂优势： 含活菌的局部制剂能够直接补充皮肤微生物群，显著改善特应性皮炎的炎症状态。特别地，海藻酸-木薯微球（alginate-tapioca microspheres）包埋系统与油包水型霜剂基质具有最佳相容性，可通过透明质酸涂层密封结构，在24小时内维持细菌活性，并实现对皮肤病原体的选择性抑制（对金黄色葡萄球菌生长抑制达-2.82 log，而对表皮葡萄球菌等共生菌无显著影响）。凝胶局限： 凝胶难以承载活菌包埋系统。凝胶的高水活度（water activity）和快速蒸发特性不利于工程菌长期存活；且凝胶基质通常需添加三乙醇胺等碱性中和剂调节pH至6.0-7.0以形成凝胶结构，这不仅破坏皮肤酸性环境，还可能对敏感皮肤产生刺激性。相比之下，霜剂形成的半封闭湿润环境更适合工程菌定植和持续分泌效应分子。

2. 老年皮肤微环境适配性：封闭保湿与pH调控

屏障修复与封闭性（Occlusivity）： 老年湿疹患者皮肤经皮水分流失（TEWL）显著增加，角质层含水量降低，需要高封闭性制剂锁住水分、修复屏障。文献明确指出：凝胶封闭性最低（"Gels are the least occlusive"），水含量高但蒸发快，无法有效降低TEWL；而霜剂（油水乳化体系）提供中等至高等封闭性，能持续保湿6-24小时，模拟皮脂膜功能，缓解老年皮肤干燥（xerosis）。酸性微环境维持： 老年患者皮肤表面pH常>6.0，破坏了酸性保护膜（acid mantle）。霜剂可稳定维持弱酸性pH（4.5-5.5），与工程菌分泌的乳酸协同，快速恢复皮肤酸性环境——此环境既抑制金黄色葡萄球菌（最适pH 7.0-7.5）增殖，又激活宿主酸性鞘磷脂酶促进神经酰胺合成，修复皮肤屏障。

3. 可控定植与给药便利性："药物即容器"策略

营养缓释与生物遏制： Module V的D-丙氨酸营养缺陷型安全策略要求制剂作为"供给站"（supply station）。霜剂的油水乳化体系可缓释D-丙氨酸，确保工程菌仅在霜剂覆盖区域存活，一旦脱离即停止生长，形成"电子围栏"效应（physical biocontainment）。凝胶的三维水基网络结构难以稳定封装D-丙氨酸等营养因子，且无法实现可控缓释。老年患者依从性： 临床文献指出，凝胶"理想用于油性或易长痘皮肤"（ideal for oily or acne-prone skin），因其快速吸收、无残留；而老年湿疹患者皮肤极度干燥，需要"厚重"（thick & greasy）质地。霜剂在保湿性与患者接受度间取得平衡，且涂抹频率（每3-4小时）低于凝胶（因蒸发快需更频繁补涂），更适合老年患者长期使用。

2.1 工程循环：StaphDress智能护肤霜

合成生物学工程遵循"设计-建造-测试-学习"（DBTL）循环，这是我们整个项目的指导原则。举个说明性的例子，我们的主要目标是改善表皮微生态，需要兼顾定向杀菌与微生态调节。为了实现这一目标，我们巧妙地采用了DBTL循环，其详细概述如下：

图8：合成生物学DBTL循环——设计-建造-测试-学习

Cycle 1：Design

为了达到治疗老年湿疹的目的，我们进行了初步设计：

抗金黄色葡萄球菌：AgrC-A-ESP蛋白酶系统

金黄色葡萄球菌的致病性在很大程度上依赖于其形成生物膜（biofilm）的能力。生物膜是由细菌细胞包裹于自分泌的胞外聚合物（extracellular polymeric substances, EPS）基质中形成的多细胞聚集体，其结构赋予细菌显著的生存优势：对宿主免疫防御的物理屏蔽、对抗生素渗透的阻力增强、以及代谢休眠状态下的持久存活[26]。表皮葡萄球菌作为健康皮肤的优势共生菌，其部分菌株分泌的内源性丝氨酸蛋白酶Esp。成熟Esp分子量约为27 kDa，其编码基因esp来源于ATCC 12228标准菌株，该基因表达pro-Esp，通过未知蛋白酶的作用，pro-Esp可转化为成熟的Esp。鉴于表皮葡萄球菌Esp与金黄色葡萄球菌V8在序列上具有高度相似性，且其酶活性也相似，因此用于激活pro-V8的金属蛋白酶热裂解酶也被用来切割pro-Esp的N端前肽。

研究表明，Esp能够切割金黄色葡萄球菌的自溶酶并抑制其生物膜的形成，是解除金黄色葡萄球菌定植作用的理想靶点[24]。然而，研究数据表明细菌的蛋白酶ESP也可能是一种致敏源，它能切割并激活警报因子IL-33，介导特应性皮炎的过敏反应。合成生物学的方法完美的解决了这个问题——通过建立在AgrC-A双组分信号转导系统：工程菌携带经过优化的金黄色葡萄球菌agrC和agrA基因，能够识别金黄色葡萄球菌分泌的I-IV型自诱导肽（AIP），进而激活P2-P3启动子，启动Esp的表达与分泌。

图9：AgrC-A双组分信号转导系统响应AIP信号激活Esp表达[27]

工程菌底盘：人葡萄球菌 OR 表皮葡萄球菌

我们考虑了两种底盘菌。第一种选择是人葡萄球菌：Nakatsuji等人的研究首次将凝固酶阴性葡萄球菌CoNS中分离的人葡萄球菌A9（ShA9）开发为治疗特应性皮炎的活体生物治疗产品，并在I期随机临床试验中验证了安全性与初步疗效[11]。ShA9对皮肤微生物群具有选择性作用，实验数据表明，使用ShA9后，金黄色葡萄球菌的序列读数频率下降，而人表皮葡萄球菌的相对比例上升；ShA9具有直接杀伤金黄色葡萄球菌的作用，同时产生AIP能够抑制金黄色葡萄球菌的群体感应机制；ShA9不会引起严重的不良反应，实验组的不良反应发生率显著低于对照组。人葡萄球菌对金黄色葡萄球菌的杀伤作用与对表皮微生态的保护作用使其成为理想的工程菌底盘，将其与AgrC-A-ESP蛋白酶系统结合是一枚双刃剑——一方面，人葡萄球菌原有的群体感应机制可能使得AgrC-A-ESP蛋白酶系统沉默；另一方面，AgrC-A-ESP蛋白酶系统可以防止金黄色葡萄球菌耐受以及面对一些菌种（如MRSA）的激活作用。需要评估该系统对金黄色葡萄球菌AIP的敏感性。

表皮葡萄球菌作为另一种选择：其在健康皮肤菌群中的主导地位（10⁴-10⁶ CFU/cm²）、更完善的分子生物学工具基础，以及天然分泌的Esp丝氨酸蛋白酶成为智能杀菌模块的理想功能模板。同时，历年的IGEM项目也证实了对表皮葡萄球菌的技术改造的可行性。

研究表面，对比表皮葡萄球菌，人葡萄球菌的机会致病风险更小，具有更强的安全性；大部分菌株有杀伤金黄色葡萄球菌、降低定植作用；具有不杀伤表皮益生菌，改善局部微生态的效应等等优点。此外，尚无研究表面人葡萄球菌分泌ESP蛋白，这不会对我们AIP响应性ESP分泌的设计方案造成影响。因此我们选择人葡萄球菌/ATCC 27844作为底盘。

阻断瘙痒循环：PsarA-IL-31scFv抗体-PAR1拮抗肽系统

2004年首次发现 IL-31 是导致特应性皮炎（湿疹）瘙痒的元凶[28]。研究证明，阻断 IL-31 通路（Nemolizumab）能显著缓解老年湿疹瘙痒；另外，最近的研究表明，金黄色葡萄球菌通过独立于炎症的神经免疫机制直接导致瘙痒：细菌丝氨酸蛋白酶V8激活感觉神经元上的蛋白酶激活受体1(PAR1)，触发绕过传统炎症途径的瘙痒信号[20]。PAR1受体拮抗剂能有效减轻瘙痒症状。因此，我们设计31scFv抗体-PAR1拮抗肽双靶点系统，串联强启动子PsarA持续表达。鉴于IL-31VHH纳米抗体还需从头设计，我们选择了IL-31scFv；Pepducins是脂化（棕榈酰化）的胞内环衍生肽，通过锚定在细胞膜上阻断PAR1与G蛋白偶联。其中P1pal-7（KKSRALF）是可以结合PAR1第三胞内环（i3），稳定受体在非活性构象。这一分子具有短序列（易于合成），进入灵长类动物模型验的优势，可直接应用于本项目。

Cycle 1：Build

工程质粒：pLI50

pLI50是金黄色葡萄球菌-大肠杆菌穿梭质粒，全长5505 bp，携带大肠杆菌pUC19复制起点（oriE）、金黄色葡萄球菌pC194复制起点（oriS）[29]。拷贝数调控通过突变pC194复制起点中的反义RNA调控区实现，高拷贝版本用于早期概念验证，低拷贝版本用于最终产品以减少代谢负担。该质粒在葡萄球菌中属于中等拷贝载体，平衡了基因表达强度与代谢负担。pLI50原始多克隆位点上游的Pspa启动子在表皮葡萄球菌中的转录效率显著降低，因此采用强启动子PsarA作为替代。

工程元件：promoter-RBS-SP-target gene-terminator

基于pLI50的改造骨架命名为pSD1（StaphDress version 1），具体元件如下：

模块 长度 元件 目标
模块I ~2.5 kb AgrC-A-I/II、PAgr P2/3、RBS、SPAtlE、Esp、TLambda t0 AIP感知-Esp响应智能杀菌
模块II ~1.8 kb P PsarA +RBS、SPLip、IL-31 scFv(GGGGS)-TAT-6x His Tag、PAR1拮抗肽、TtufA 双靶点止痒，TAT透皮增强

模块I：首先，AgrC-A系统克隆自金黄色葡萄球菌NCTC 8325，包括AgrC（组氨酸激酶受体）与AgrA（响应调节子）。不同Agr基因群的金黄色葡萄球菌菌株对相应的AIP信号响应，亚洲以AIP-I和AIP-II为主，我们首选AgrC-A-I。Agr P3启动子是金黄色葡萄球菌群体感应的核心开关，专门响应 AIP 分子。

图10：金黄色葡萄球菌AIP信号类型及其结构[27]

其次，如果金黄色葡菌球菌爆发，我们需要在短时间内产生大量的Esp。强 RBS 序列能显著提高 mRNA 翻译成蛋白的效率。对于革兰氏阳性菌，标准的强 RBS 序列是 5'-AGGAGG-3'。第三，AtlE是一种分子量为 60-kDa 的主要表面蛋白，具有双重功能：水解酶活性和黏附功能。表达SPAtlE (Signal Peptide from Autolysin E) 是保证细菌"粘"在聚合物表面形成生物膜的第一步关键介质，从而保证Esp能够被分泌出去接触金黄色葡菌。第四，尚无研究证明人葡萄球菌会产生Esp蛋白酶，必须导入esp基因。天然的Esp是以无活性的前体分泌的，需要某种未知蛋白酶激活，尽管实验证明同源的V8蛋白酶可以激活Pro-Esp的活性，但是为了保证我们的工程菌分泌出来立刻能杀菌，我们直接表达成熟肽。最后，TLambda t0 强终止子保证了模块之间的正交性，即互不干扰。

图11：Esp蛋白酶前体结构与成熟肽切割位点[24]

模块II：首先，湿疹患者的瘙痒是持续的，我们需要药物像"护肤霜"一样 24 小时源源不断地分泌。P PsarA 强组成型启动子是葡萄球菌的全局调控因子，该启动子在各种生长阶段均保持高活性。其次，scFv抗体是一种结构非常复杂的蛋白，如果翻译速度太快，蛋白来不及正确折叠，就会失去了生物活性，因此选择中等强度RBS。第三，表皮葡萄球菌分泌大量的脂肪酶，说明其信号肽非常高效。模块I用了SPAtlE，为了防止质粒上出现两段相同的 DNA 导致同源重组，改用脂肪酶的SPLip信号肽。第四，IL-31 scFv用于中和IL-31；连接肽(GGGGS)为抗体折叠提供了必需的空间自由度；穿膜肽（TAT Peptide）帮助抗体渗透皮肤表面；组氨酸标签 (6x His Tag)通过抗His实验检验IL-31 scFv。第五，PAR1拮抗肽作用于神经末梢，可在较浅层释放，无需穿膜肽；两种分子共享SPLip信号肽，通过F2A或T2A"自切割"肽连接实现等摩尔表达。最后，再次强调正交性，使用表皮葡萄球菌自带的TtufA强终止子避免序列重复。

Cycle 1：Test

菌株筛选：

底盘菌株的安全性评估需达到疫苗级别的严谨标准。凝固酶阴性确认采用试管法与玻片法双重验证，排除任何凝固酶阳性污染。毒力因子基因组扫描检测α-毒素、Panton-Valentine杀白细胞素、中毒性休克综合征毒素-1、肠毒素等金黄色葡萄球菌特征毒力基因，以及潜在毒力因子如icaADBC、aap过度表达等位基因。抗生素敏感性谱测定遵循CLSI M100标准，优选多重敏感菌株，为后续可能的感染事件保留治疗选择。生物膜过度形成能力排除采用微量滴定板结晶紫染色法，定量生物膜形成指数（BFI），排除BFI>0.5的强生物膜形成株，降低感染风险。预期结果：未检测到危险菌株。

需要评估底盘菌珠对表皮微生态的影响。采用改良的琼脂扩散法：将候选菌株点种于含0.5%脱脂乳的BHI琼脂平板，同时在其周围点种荧光标记的金黄色葡萄球菌，37℃共培养18小时后测量抑制圈直径与透明度；将菌株印记到荧光标记的表皮葡萄球菌的培养基，37℃共培养18小时后再次测量抑制圈直径与透明度。排除对表皮葡萄球菌有抑制作用的菌株。预期结果：未检测到危险菌株。

质粒构建：目的基因获取、载体组装、转化与标记

目的基因获取（IL-31 scFv、PAR1拮抗肽、成熟Esp）

鉴于人葡萄球菌（S. hominis）/ATCC 27844的遗传操作工具尚不完善，我们选择全基因合成（Gene Synthesis）密码子优化策略：

IL-31 scFv：基于已报道的抗IL-31抗体序列（如BMS-981164或类似克隆），进行人葡萄球菌密码子偏好性优化；PAR1拮抗肽：选择P1pal-7（KKSRALF）的编码序列；成熟Esp（mEsp）：基于ATCC 12228菌株的esp基因序列，删除编码前肽（pro-peptide）的区域（约N端200-300 bp），直接表达成熟蛋白酶（~27 kDa）。

根据葡萄球菌属密码子使用分析，优先使用TTG（Leu）、ATT（Ile）、AAA（Lys）等高频密码子，避免使用CGT/CGC/CGA/CGG（Arg）等低频密码子，并最小化5'端RNA二级结构以增强翻译效率。

载体组装：pSD1质粒构建

采用Golden Gate Assembly或Gibson Assembly策略：pLI50经限制性内切酶（如EcoRI/HindIII）线性化，去除原始Pspa启动子区域；模块插入顺序按照：Module I（AgrC-A-I/II + P2-P3 + mEsp）→ Module II（PsarA + scFv-P2A-PAR1）→ 终止子；同源臂设计：各模块间保留20-30 bp重叠区域用于Gibson Assembly，避免使用重复序列（防止同源重组）。

人葡萄球菌ATCC 27844的获取与转化

购买自ATCC（货号27844），标准株为S. hominis subsp. Hominis；质粒需要获取氯霉素抗性与GFP标记。pLI50本身携带氯霉素乙酰转移酶（cat）基因，赋予氯霉素抗性（5-10 μg/mL）；采用经密码子优化的GFP（Sa2版本），克隆至pLI50的独立表达盒（使用PsarA启动子）。

构建后的pSD1质粒经通过电转化共转入。感受态制备：将S. hominis培养至OD600=0.6-0.8，收集菌体，用含0.5 M蔗糖的冰冷电穿孔缓冲液洗涤3次；电转参数：电压2.0-2.5 kV，电容25 μF，电阻200 Ω，电击时间4-5 ms（参考S. aureus电转化方案，频率可达7.6×10⁵ transformants/μg DNA）；恢复培养：电转后立即加入BHI+0.5 M蔗糖恢复培养3小时，涂布含氯霉素的BHI琼脂平板。

功能模块验证：

模块I：首先，检测AgrC-A功能：将Pspa-gfp融合基因克隆至pSD1质粒，转化人葡萄球菌/ATCC 27844，与AIP-I至AIP-IV按一定浓度梯度共培养，流式细胞术检测GFP荧光。预期结果：AIP-I诱导最强，AIP-II和AIP-IV诱导弱10-100倍，AIP-III无显著诱导。

其次，Esp蛋白酶活性检测采用FRET底物和Western blot。采用Esp无活性突变体作为对照，验证信号特异性。

最后，选择性杀菌验证采用共培养竞争实验：人葡萄球菌/ATCC 27844（氯霉素抗性，GFP标记）与金黄色葡萄球菌（mCherry标记）以1:1、1:10、10:1比例混合，BHI培养基37℃振荡培养24小时，流式细胞术计数。预期结果：1:1比例下，24小时金黄色葡萄球菌下降2-3 log，工程菌维持稳定或轻度增长。

模块II：采用背根神经节神经元瘙痒信号检测。预期结果：工程菌培养上清预处理30分钟后，V8蛋白诱导的钙流峰值下降>70%，IL-31诱导下降>60%，联合应用接近完全阻断。

Cycle 1：Learn

选择人葡萄球菌作为底盘，其本身可通过分泌AIP干扰金黄色葡萄球菌Agr系统，同时导入AgrC-A-Esp系统确保在金黄色葡萄球菌的群体感应耐受情况下仍能解除定植。

然而，我们发现：人葡萄球菌在老年干燥皮肤上的定植能力未经证实，老年皮肤pH升高（>6.0）和皮脂减少可能显著降低工程菌存活率与药物分泌。同时，仅仅接触金黄色葡萄球菌的定植并不能改变老年人表皮成分与微生态之间的恶性循环。这提示了需要进一步完善我们的工程菌。

Cycle 2：Design

表皮微生态是不同微生物与人表皮相互作用的结果，益生菌疗法尤其要注意的是能否在局部有效定植。年湿疹治疗的有效性高度依赖于工程菌在目标微环境中的存活与功能执行能力。与年轻成人皮肤相比，老年皮肤呈现多重生理衰退：角质层经皮水分流失增加，皮脂分泌量减少，表面pH升高。这些变化共同构成了对微生物定植的严峻挑战。

我们计划使用人葡萄球菌改善局部微生态，需要验证人葡萄球菌在老年湿疹患者皮肤的定植能力。此外，我们的团队还与我们大学的一位微生物研究专家进行了线上讨论，他肯定地同意我们的观点，如果我们不能改善老年人表皮的微环境，人葡萄球菌很可能无法定植，从而丧失疗效。

通过文献调查我们发现：酸性条件下，表皮葡萄球菌的鞘磷脂酶活性产生对屏障完整性至关重要的神经酰胺；短链脂肪酸调节角质形成细胞分化和炎症反应。这给我们启发通过增强细菌产酸改善局部微生态的启发。虽然葡萄球菌属天然具备LDH（ldh基因，受Rex调控子调控），但在老年皮肤高pH环境下，天然表达水平不足以快速建立酸性屏障。我们设想：如果过表达乳酸脱氢酶使工程菌持续分泌乳酸，在完成任务后自然降低局部pH至4.5-5.5，既抑制嗜中性pH的金黄色葡萄球菌增殖，又激活宿主酸性鞘磷脂酶促进神经酰胺合成，修复皮肤屏障。

Cycle 2：Build

模块III：为了快速建立酸性屏障，我们沿用模块III的关键元件，构建了PsarA-Strong TIR-RBS-SPAtlE-LDH1全长序列-TLambda t0的线路。目的基因来自表皮葡萄球菌 ATCC 12228的ldh1基因（编码L-乳酸脱氢酶，SA0232位点）。

Cycle 2：Test

老年皮肤适应性专项评估：

低湿度适应性测试在控制湿度培养箱中进行，设置相对湿度30-40%（冬季室内环境）、温度32℃（皮肤表面温度）。候选菌株在该条件下培养48小时后，活菌计数下降<1 log的菌株判定为优秀。弱酸性pH生长优势验证采用pH梯度培养法，在pH 4.5、5.0、5.5、6.0、7.0的BHI培养基中比较生长曲线，优先选择在pH 4.5-5.5区间相对生长率>80%的菌株。皮脂利用效率分析通过脂质组学方法定量菌株分解甘油三酯、游离脂肪酸的能力，评估lip基因簇的表达活性。角质形成细胞共培养相容性采用Transwell体系，将候选菌株与老年供体来源的原代角质形成细胞共培养72小时，检测细胞活力（MTT法）、炎症因子（IL-6、IL-8、TNF-α）释放及屏障功能标志物（兜甲蛋白、内披蛋白）表达，排除可能引起额外皮肤刺激的候选者。

评估维度 测试条件 关键指标 通过标准
低湿度适应性 相对湿度30-40%，32℃，48小时 活菌计数下降幅度 <1 log
弱酸性pH优势 pH 4.5-5.5 和 6.0-7.0生长曲线 相对生长率 >80%
皮脂利用效率 三油酸甘油酯为唯一碳源 生长速率、脂肪酶活性 提升3倍
细胞相容性 与老年角质形成细胞共培养 细胞活力、炎症因子释放 无显著毒性

功能模块验证：

使用等效3D皮肤模型，将含工程菌（10⁶ CFU/cm²）涂抹于皮肤模型表面，覆盖半透膜模拟封闭环境。分别在0h、4h、8h、12h、24h使用平面pH微电极直接测量皮肤表面；冷冻切片后，使用pH敏感染料（如SNARF-4F）结合共聚焦显微镜定量。设置未改造表皮葡萄球菌对照组与化学乳酸对照组。预期结果：24小时内维持pH 4.5-5.5（±0.3），且金黄色葡萄球菌（共接种10⁵ CFU/cm²）计数下降>2 log；24小时检测pH不低于4.0（避免过度酸化刺激），角质形成细胞活力（MTT法）>90%，炎症因子（IL-6、IL-8）释放不高于未处理对照。

Cycle 2：Learn

我们的策略通过PsarA强启动子驱动LDH1过表达，确保乳酸持续分泌，快速将老年皮肤pH从>6.0恢复至4.5-5.5，既抑制金黄色葡萄球菌（最适pH 7.0-7.5）又激活宿主酸性鞘磷脂酶促进神经酰胺合成，实现"杀菌-修复"双效合一。

但是引入产酸模块同样面临着许多挑战：LDH1持续高表达可能消耗过多NADH，影响细菌生长活力；过度酸化（pH<4.0）可能刺激老年皮肤；引入过多的功能模块可能导致质粒无法成功构建。这提示我们后续可能需要进一步优化设计，平衡产酸能力与细菌适应性，或引入pH感应负反馈回路防止过度酸化。对此，我们将在实验中进一步评价这一策略的效果与安全性。

Cycle 3：Design

在小组讨论中，我们意识到：虽然人葡萄球菌极少发生机会感染，且工程菌底盘经过早期的安全性筛选，引发安全风险的概率极低。但是基于工程化改造中可能出现的变异和各种不可控因素，安全性模块是必须补充的。

常规物理和化学方法具有强大的灭菌作用，但它们使用起来不方便，并且可能对用户造成意外伤害的风险，因此终止开关是更好的选择。经过与历年优秀项目组成员进行交流后我们肯定了这一想法。

常见的终止开关策略包括温度控制、氧气控制、光控制和PH控制，所有这些都基于内部和外部环境之间的固有差异。我们决定选择目前最成熟的策略，温度控制策略。我们设想，在人体表皮32°C时，工程菌可以正常生长；当它们进入人体并且温度升高至37°C时，有毒蛋白（如mazF、ccdB、rel等）的表达升高，导致工程菌死亡，从而防止基因泄漏。

安全保险：温控自杀开关

Rex蛋白原本是结合在DNA上，抑制那些无氧代谢相关基因的表达。当它脱落后，细菌的RNA聚合酶就可以开始工作。这些无氧代谢基因主要分为几类，专门用于在无氧环境下再生NAD⁺，从而维持能量产生。在有氧环境（正常皮肤表面）下，它是关闭的；在缺氧或一氧化氮压力升高（进入人体深层组织/血液）时，它会被强烈激活。FourU RNA温度计是一个位于mRNA本身上的"热敏开关"，它能够帮助沙门氏菌在进入宿主（体温37℃）时迅速开启防御机制。这种RNA温度计之所以被命名为"FourU"，是因为其结构中用于锁定RBS的关键配对区域，恰好由四个连续的尿嘧啶（U）核苷酸组成。这种A-U碱基对（相对于G-C碱基对）的结合力较弱，对温度变化极其敏感，从而赋予了它作为精确温度开关的物理基础。这使得它能够快速且特异地在宿主温度下做出响应。人表皮的温度平均温度在28℃-34℃之间，低于循环体温（37℃）；同时，表皮是微氧环境而循环血液是厌氧环境。据此，我们设计了模块III。

Cycle 3：Build

模块IV：Pldh1启动子（微氧响应）→ FourU热敏核糖开关（温度响应，Tm≈36℃）→ MazF毒素（效应执行）这一"与门"逻辑确保"表皮卫士"仅在皮肤表面正常执勤（微氧，~32℃），一旦误入核心体温环境，在厌氧与37℃的双重条件下解除抑制。MazF 毒素在Rex脱落后可以翻译出MazF毒素，裂解人葡萄球菌。为了防止MazF发生转录通读，保持序列正交（防止同源重组质粒丢失），需要第三个完全不同的强效终止子。终止子 TgyrA具备典型的强效 Rho-independent 终止子特征。

Cycle 3：Test

FourU RNA温度计热敏性验证：

将FourU元件（含RBS）与gfp融合，构建于pLI50中，转化工程菌。分别在32℃（皮肤温度）和在37℃（核心体温）下培养，使用流式细胞术定量检测GFP阳性率。预期结果：32℃时<10%，37℃时>80%。

Rex-Pldh1微氧响应验证：

工程菌分别在厌氧罐（或0.1% O₂）和有氧（21% O₂）条件下培养，使用Western blot检测MazF表达，或通过活菌计数评估杀伤效率。预期结果：厌氧条件下（Rex解离），37℃时细菌存活率<0.01%；32℃有氧条件下存活率>95%

Cycle 3：Learn

我们的策略有如下优点：Pldh1（微氧响应）与FourU（温度响应）双重保险，仅在"37℃+厌氧"（血液环境）同时满足时激活MazF，避免单一信号泄漏导致的误杀，确保皮肤表面（32℃+微氧）正常执勤；利用生理参数（温度、氧气）作为触发信号，无需外源化学诱导剂，符合老年患者用药简便性需求，降低医疗成本。

但是，夏季高温环境或发热患者皮肤温度可能接近37℃，存在误触发风险。这可能提示需进一步测试工程菌在35-36℃边界温度的存活率，调整FourU的Tm值。

Cycle 4：Design

在与相关领域的专家讨论时，我们发现我们的安全模块存在一个缺陷，即制控的考虑。此外，我们进行了的一项在线问卷调查显示：老年湿疹患者大多对合成生物产品的了解不够，对于细菌治疗的安全性存在怀疑，可能导致实际产品的依从性降低。

为了克服这一障碍，我们构思了通过引入药物依赖性设计体外遏制系统的想法。在优秀团队成员的建议下，我们更加坚定这个想法，收集和筛选药物控制策略。

产品即容器：D-丙氨酸营养缺陷型菌株

细菌的细胞壁（肽聚糖）合成必须依赖 D-丙氨酸。但是自然界中主要存在的是 L-丙氨酸。细菌依靠 alr 基因将 L-丙氨酸转化为 D-丙氨酸。如果敲除人葡萄球菌基因组上的 alr 基因，使其成为依赖外源性D-丙氨酸才能生长的营养缺陷型菌株。把它混在富含 D-Ala 的护肤霜里，它能存活并分泌药物，如果脱离了护肤霜细菌就会死亡。

Cycle 4：Build

模块V：采用CRISPR/Cas9技术。首先，pCasSA (质粒Addgene #98211) 是科学家专门为葡萄球菌量身定制的载体系统，它能在人皮葡萄球菌里高效、稳定地切开 DNA[30]。其次，利用软件（如 Benchling 或 CHOPCHOP）在 alr 基因内部找到一段特异性的 20 bp 序列，这段 20 bp 的sgRNA Spacer导航序列将引导 Cas9 前往alr 基因。最后，采用同源重组避免突变风险：HA-L (左同源臂) 修复模板的左半边，截取 alr 基因上游紧挨着的 ~500 bp 序列；HA-R (右同源臂) 修复模板的右半边，截取 alr 基因下游紧挨着的 ~500 bp 序列；构建HR Template（完整同源修复模板）替换原有基因。

Cycle 4：Test

D-丙氨酸营养缺陷型验证：

基因型验证：使用alr基因外侧引物，确认Δalr缺失（预期无扩增条带，或条带大小符合替换片段）；细菌在BHI（无D-Ala）和BHI+5 mM D-Ala平板上划线；在无D-Ala液体培养基中培养。预期结果：仅补充组生长；无D-Ala时细菌不增加，补充后正常生长

体外遏制效率验证：将工程菌（10⁷ CFU）接种于无D-Ala的BHI中，37℃培养72小时，定期涂板计数。预期结果：72小时后活菌数<10 CFU/mL（下降>6 log），且回复突变率<10⁻⁷。

Cycle 4：Learn

alr营养缺陷型工程菌仅在含D-丙氨酸的护肤霜中存活，一旦脱离即停止生长。这完美的预防了细菌过度定植引发微环境紊乱的情况。同时，D-丙氨酸为食品级添加剂，成本低且无毒性，易于在配方中实现，适合老年患者长期使用。

但是我们也发现，尽管CRISPR/Cas9技术相当成熟，由于表皮葡萄球菌具有活跃的限制修饰系统，且同源重组能力较弱，因此使用传统的基因敲除或转座子诱变技术在其身上进行实验既具有技术难度，又耗时较长。这可能给我们的实验带来挑战。

3. 基因线路和零件

3.1 基因线路

我们设计了如图所示的工程线路与质粒：

图12：工程菌基因线路设计——包含智能响应杀菌、止痒、温控自杀和营养缺陷模块

pCasSA质粒图13：pCasSA质粒图谱（Addgene #98211）——CRISPR/Cas9基因组编辑载体[30]

pLI50质粒图14：pLI50质粒图谱——金黄色葡萄球菌-大肠杆菌穿梭质粒[29]

模块I：智能响应杀菌模块

  1. AgrC-A-I/II双组分系统（组氨酸激酶受体AgrC + 响应调节子AgrA），特异性识别金黄色葡萄球菌AIP-I/II型信号（亚洲流行株为主）。
  2. AgrC磷酸化传递信号至AgrA，激活P2-P3启动子（群体感应核心开关）。
  3. 强RBS（AGGAGG）驱动成熟Esp（mEsp，去除pro-peptide）表达，经SPAtlE信号肽引导分泌至胞外。
  4. Esp选择性降解金黄色葡萄球菌生物膜蛋白（Aap、SasG、FnBPA），解除定植。

模块II：神经免疫调控止痒模块

  1. PsarA强组成型启动子（全局调控因子SarA结合位点），确保24小时持续表达。
  2. 效应分子1（抗炎）：IL-31 scFv（VH-(GGGGS)₃-VL）融合TAT穿膜肽（YGRKKRRQRRR）和6xHis标签，穿透角质层中和IL-31。
  3. PAR1拮抗肽P1pal-7（KKSRALF）或基于Vorapaxar的短肽，阻断V8蛋白酶-PAR1通路。
  4. P2A自切割肽实现scFv与PAR1拮抗肽的等摩尔表达；双SPLip信号肽确保两者独立分泌（scFv需TAT透皮，PAR1拮抗肽直接作用于表皮神经末梢）。

模块III：微环境酸化和屏障修复模块

  1. PsarA启动子驱动LDH1（L-乳酸脱氢酶，来自S. epidermidis ATCC 12228）过表达。
  2. SPAtlE引导LDH1分泌至胞外（与Module I共享信号肽类型，避免质粒重组）。
  3. 代谢输出：持续分泌乳酸，降低局部pH至4.5-5.5，激活宿主酸性鞘磷脂酶，促进神经酰胺合成，修复屏障。

模块IV：温度控制自杀模块

  1. Pldh1启动子（乳酸脱氢酶启动子）受Rex蛋白调控，在皮肤表面（有氧）关闭，在血液/深层组织（厌氧）激活。
  2. FourU RNA温度计（Tm≈36℃），在32℃（皮肤）时折叠遮蔽RBS，在37℃（核心体温）时熔解暴露RBS。
  3. MazF毒素（mRNA干扰酶，切割ACA序列），在"厌氧+37℃"条件下翻译，裂解细菌mRNA导致死亡。

模块V：代谢营养缺陷模块

  1. 使用pCasSA质粒（Addgene #98211）递送CRISPR/Cas9系统，靶向alr基因（丙氨酸消旋酶）。
  2. 同源臂（HA-L: alr上游500bp + HA-R: alr下游500bp）介导alr完全缺失，避免移码突变残留蛋白表达。
  3. 工程菌成为D-丙氨酸营养缺陷型（D-Ala auxotroph），离开护肤霜（含外源D-Ala）即停止生长。

3.2 基础零件

模块I：智能响应杀菌模块

元件类别 具体元件 来源/序列特征 功能
启动子 Agr P2/P3 S. aureus NCTC 8325 群体感应响应启动子，受AgrA激活
感应蛋白 AgrC-A-I/II 基因合成（密码子优化） 双组分信号转导系统
RBS Strong RBS 5'-AGGAGG-3' 强核糖体结合位点，高翻译效率
信号肽 SPAtlE S. epidermidis 引导Esp分泌至胞外
效应基因 mEsp ATCC 12228（去除pro-peptide编码区） 成熟丝氨酸蛋白酶，降解金葡菌生物膜
终止子 TLambda t0 λ噬菌体 强转录终止子，确保正交性

模块II：神经免疫调控止痒模块

元件类别 具体元件 来源/序列特征 功能
启动子 PsarA S. aureus 强组成型启动子，持续驱动
RBS Medium RBS 优化序列（避免过快翻译） 平衡scFv折叠与翻译速度
信号肽1 SPLip S. epidermidis lipase 引导scFv分泌（与SPAtlE序列不同，防重组）
效应基因1 IL-31 scFv 基因合成（基于BMS-981164） 单链抗体，中和IL-31
Linker (GGGGS)₃ 柔性连接肽 连接VH/VL，提供折叠空间
穿膜肽 TAT YGRKKRRQRRR 介导scFv穿透角质层
标签 6xHis HHHHHH 便于Western检测
自切割肽 P2A ATNFSLLKQAGDVEENPGP 实现scFv与PAR1肽等摩尔切割
信号肽2 SPLip 同前 引导PAR1拮抗肽分泌
效应基因2 PAR1拮抗肽 P1pal-7 (KKSRALF)或Vorapaxar衍生物 阻断PAR1受体，抑制神经瘙痒
终止子 TtufA S. epidermidis 强终止子，避免通读

模块III：微环境酸化和屏障修复模块

元件类别 具体元件 来源/序列特征 功能
启动子 PsarA 同Module II 强组成型驱动
RBS Strong TIR 强翻译起始区 确保LDH1高表达
信号肽 SPAtlE 同Module I 引导LDH1分泌
效应基因 LDH1 S. epidermidis SA0232 L-乳酸脱氢酶，产乳酸
终止子 TLambda t0 同Module I 转录终止

模块IV：温度控制自杀模块

元件类别 具体元件 来源/序列特征 功能
启动子 Pldh1 S. aureus 微氧诱导启动子，Rex调控
核糖开关 FourU 合成（UUUU核心区，Tm≈36℃） 温度敏感RNA开关，32℃遮蔽RBS，37℃暴露
效应基因 MazF E. coli（密码子优化） mRNA毒素，切割ACA序列
终止子 TgyrA S. aureus gyrA基因终止子 强效Rho-independent终止子

模块V：代谢营养缺陷模块

元件类别 具体元件 来源/序列特征 功能
编辑工具 pCasSA Addgene #98211 温度敏感型CRISPR/Cas9质粒
Cas9 SpCas9 S. pyogenes RNA引导的DNA切割酶
sgRNA alr-targeting 软件设计（Benchling/CHOPCHOP） 引导Cas9至alr基因座
修复模板 HR Template HA-L (500bp) + HA-R (500bp) 同源重组修复，敲除alr
筛选标记 NeoR/KanR pCasSA自带 新霉素/卡那霉素抗性筛选

4. 实验和预期结果

4.1 湿实验

1. 底盘菌筛选

实验设计：

预期结果：

2. 老年人表皮环境测试

实验设计：

预期结果：

3. 目的基因的获取（模块I-IV）

实验设计：

基因合成：委托GenScript/IDT合成以下优化序列（S. hominis密码子优化）：

  1. Module I: agrC-I/II (双拷贝), agrA-I, mEsp (成熟Esp，无前肽)
  2. Module II: IL-31 scFv (VH-(GGGGS)₃-VL-TAT-6xHis), PAR1拮抗肽 (P1pal-7: KKSRALF)
  3. Module III: ldh1 (全长)
  4. Module IV: FourU-MazF 融合序列（含SD序列和间隔区）

密码子优化：避免AGG/AGA (Arg)、TTA (Leu)等稀有密码子，GC含量调整至35-45%。

合成载体：pUC57或pMA-T（氨苄抗性），测序验证（Sanger测序，正反向引物覆盖全长）。

预期结果：

4. pSD1质粒的构建（模块I-IV）

实验设计：

预期结果：

5. pCasSA载体的构建（模块V）

实验设计：

预期结果：

6. 转化分析

实验设计：

预期结果：

7. 治疗策略验证（模块I、II）

实验设计：

Module I功能验证：

  1. AgrC-A响应性：工程菌（pSD1-GFP报告，Pspa-gfp替换为Agr P2/3-gfp）与AIP-I至AIP-IV（合成肽，0-10 μM）共培养，流式细胞术测GFP荧光。
  2. Esp活性：FRET底物（含Aap蛋白片段）与工程菌上清孵育，荧光酶标仪测切割动力学（Km, kcat）。
  3. 选择性杀菌：工程菌（GFP+，氯霉素抗性）与S. aureus（mCherry+，1:1比例）共培养，流式细胞术/荧光显微镜观察，24小时后计数。

Module II功能验证：

  1. scFv表达：Western blot（抗His抗体）验证scFv-TAT-His表达与分泌。
  2. PAR1拮抗：钙流实验（如前所述），工程菌上清预处理DRG神经元，V8/IL-31刺激后测钙流抑制率。

预期结果：

8. 定植策略验证（模块III）

实验设计：

预期结果：

9. 温度控制策略验证（模块IV）

实验设计：

预期结果：

10. 药物控制策略验证（模块V）

实验设计：

预期结果：

5. 安全

在iGEM精神的指导下，我们的团队促进创新并鼓励主动性。我们非常重视 "做一个负责任的科学家或工程师"的原则， 特别是优先考虑避免对我们自己、我们的同事和环境的伤害，以便安全和保障渗透到我们的项目中。

我们牢记，"对可能的风险以及我们如何管理这些风险保持透明是成为负责任的科学家或工程师的关键组成部分"。因此，我们在实验和未来应用中提前识别了潜在风险，并提出了相关对策。值得一提的是，我们在安全模块上进行了设计和迭代，以确保工程细菌可以自我杀伤，并且如果将来使用不会对环境和人体造成伤害。此外，我们坚持实验室安全的最高标准，在人类实践中宣传安全的重要性，并遵守相关法律法规。

关于我们工作的自我检查表：

检查类别 检查项目 项目状态 应对措施
生物安全 工程菌是否含抗生素抗性基因？ 是（pLI50含Cat，pCasSA含NeoR） 最终产品仅保留Cat（氯霉素抗性）作为质粒标记，或采用无抗性标记系统（如营养缺陷互补）；Module V敲除后pCasSA在37℃丢失
工程菌是否可能水平基因转移？ 风险低 Module V营养缺陷防止环境增殖；Module IV温控自杀防止入血后存活；质粒为窄宿主范围（pC194 ori，仅限葡萄球菌）
工程菌是否产生毒素？ 是（MazF为胞内毒素） MazF仅在37℃厌氧条件下表达，且自杀后细菌裂解释放的MazF量极低，无系统性毒性
工程菌是否可能回复突变？ 是（alr回复） 双基因敲除（alr+dapD）或引入ccdB自杀基因备份，降低回复率至<10⁻¹⁴
化学安全 是否使用有害化学试剂？ 是（EB，酚/氯仿，甲醛） 实验室配备通风橱，废物分类收集，交由专业机构处理
物理安全 是否涉及尖锐器具？ 是（注射器针头，玻璃吸管） 使用安全弃针盒，破碎玻璃专用容器
伦理合规 是否涉及人体实验？ 否（现阶段） 后续临床试验需通过伦理委员会审批（IRB）
是否涉及动物实验？ 是（小鼠模型） 遵守3R原则，最小化动物数量，获得IACUC批准
环境安全 工程菌泄漏风险？ 中 BSL-2实验室操作，高压灭菌处理废液，Module V确保环境不增殖
数据安全 基因序列信息保密？ 否（公开） 公开项目序列

5.1 项目设计安全

我们进行了下面的安全设计与考量：

物理遏制

Module V（alr营养缺陷型）确保工程菌仅在含D-丙氨酸的护肤霜中存活，一旦脱离"容器"即停止生长。D-丙氨酸为细菌细胞壁合成必需，自然界中L-丙氨酸为主，人体皮肤微环境中D-丙氨酸浓度极低。工程菌在环境中（土壤、水体）无法获取D-丙氨酸，24小时内死亡，防止生态入侵。

生物遏制

Module IV（Pldh1-FourU-MazF）双因子"与门"自杀开关。FourU RNA温度计具有陡峭的温度响应曲线（32-37℃范围内翻译效率变化>100倍），结合Pldh1微氧感应，确保仅在血液环境（37℃+厌氧）激活MazF。mRNA干扰酶MazF切割细菌自身mRNA（ACA序列），不作用于真核细胞（真核mRNA无ACA偏好），对人体无毒。自杀后细菌裂解，无活菌释放。

遗传稳定性防逃逸

避免使用可转移的抗生素抗性基因；质粒为窄宿主范围（pC194 ori，仅限葡萄球菌属）。pLI50质粒无法在肠道菌群（大肠杆菌等革兰氏阴性菌）中复制，水平基因转移风险极低。Module V的基因组编辑（alr敲除）为永久性遗传改造，不引入外源可移动元件。

微生态安全性

底盘菌为人葡萄球菌，人体皮肤共生菌，凝固酶阴性。Module I的Esp选择性杀伤S. aureus，保护共生菌。人葡萄球菌 A9已在I期临床试验中验证安全性[11]。工程化改造仅增加"智能响应"和"安全开关"功能，未引入外源毒力因子。Module I的AgrC-A系统特异性识别金黄色葡萄球菌AIP，不对其他共生菌产生交叉反应。

代谢产物安全性

Module III分泌乳酸，Module II分泌scFv和短肽。乳酸为皮肤天然成分，pH 4.5-5.5为健康皮肤生理范围。scFv为大分子蛋白（~30 kDa），经皮吸收率低（<1%），主要作用于角质层和表皮浅层，无系统性暴露风险。PAR1拮抗肽P1pal-7为7肽，量极微，无全身活性。

故障安全设计

双重独立安全模块（Module IV 、 Module V），单一模块失效仍有第二重保护。若Module IV泄漏（FourU在32℃部分激活），Module V营养缺陷仍可防止环境增殖；若Module V回复突变，Module IV在入血时仍触发自杀。只有同时发生"温度开关失效"和"营养缺陷回复"双重罕见事件，才可能导致 containment失效，该概率低于自然突变率。

5.2 实验室和设备

图15：iGEM实验室设备——生物安全柜、培养箱、高压灭菌器等

实验在位于海军军医大学生物物理系的IGEM实验室进行。我们的实验室被归类为BSL-II，并符合中华人民共和国病原体实验室通用生物安全标准和高等教育实验室安全条例。

我们实验室的主要安全功能包括：

  1. 阻燃防水工作台，可耐中热、有机溶剂、酸碱、消毒剂等化学品
  2. 机械通风系统、送风、排气口均经过防风、防雨、防碎屑处理，排气系统有过滤器。
  3. 水管装有回流防止器
  4. 生物安全柜
  5. 必要的安全预防措施，如护目镜和防护手套
  6. 高压灭菌器和其他灭菌器
  7. 淋浴和洗眼
  8. 应急设备，如消防设备、急救设备
  9. 应急照明设备
  10. 出入境登记

5.3 废物处理

图16：实验室废物处理流程——分类收集、灭菌、无害化处置

  1. 实验室培养基等废物在处置前将在室内通过高压灭菌进行灭菌。
  2. 分类收集垃圾，写交接记录。
  3. 在处置前，将再次确认该烟的无毒无害性质。
  4. 容器、传染性物品、物品将贴上标签并存放在指定地点。
  5. 将进行定期维护和维修。如果任何机器报废，将进行彻底的清洁、消毒和灭菌过程。

5.4 实验室安全原则

图17：实验室安全设备——AED除颤仪、紧急淋浴装置

在整个实验过程中，我们特别注意安全原则：

  1. 实验室有紧急疏散路线图、急救箱（AED距离我们实验室50米）、消防设备等。
  2. 实验室的实验操作需要按照既定规范进行。严禁非法经营。各种设备都需要定期维护，使用后应及时关闭。如有必要，需要更换各种试剂。
  3. 实验室应有健全的废物处理方法，例如使用消毒剂杀死残留细菌，并确保无菌后再将其丢弃到下水道。例如，废弃的吸入试剂吸头应以指定的方式放置。危险品应分别丢弃在专用垃圾桶中，细胞实验室废物应置于密闭容器中，并交由专业机构处置。
  4. 区域必须严格隔离，试样必须按规定进行标记。
  5. 实验物品的保管非常重要，应给予足够的重视。化学品、仪器、设备、实验用具应按规定方法保管，并注明名称、数量、时限等信息。应注意以合理和正确的方式使用它们。使用后应按规定清洗和存放。

在项目开始时，所有成员都接受了实验室技能的全面培训，确保了对实验室内实验室仪器的正确和标准化使用有透彻的了解。培训涵盖广泛的领域，包括掌握基本的实验室技能、学习个人防护、学习如何识别常见风险以及指导如何应对事件。此外，至少需要一名讲师在场，以提供指导并确保整个实验过程中的安全。

5.5 实验技能培训

图18：实验技能培训——质粒提取、转化、电泳等基本操作

在进入实验室之前，我们会参加实验室基本技能和安全注意事项的全面培训。

实验室培训涵盖一系列特定的实验技术，如质粒提取、质粒转化、RNA提取、qPCR、琼脂糖凝胶电泳、板包被、细菌接种和扩增、裂解、色谱、荧光显微镜和酶标记装置的使用。

除了特定的实验室技能外，培训的重点是掌握实验室预防措施。这些预防措施包括但不限于仔细登记仪器使用情况、准确标记样品和试剂、严格遵守危险材料的标准化储存程序以及妥善处置废物。

未接受过安全培训或未证明熟练掌握实验室基本技能者不得参加实验。这种方法确保了更严谨、准确和可信的实验数据。此外，通过执行这些培训措施，我们最大限度地提高了实验的安全性和稳定性，从而降低了对环境和我们自己的潜在风险。

5.6 个人防护培训

图19：个人防护培训——着装、清洁、设备使用和试剂使用规范

在整个实验过程中，如何保护自己仍然是重中之重。正如我们在上一节中提到的，每个成员都积极参与学习个人防护，并严格遵守实验室指南，以尽量减少潜在的危险。个人防护的要点概述如下：

敷料：每个团队成员必须穿着标准化的长袖实验室外套、长裤、手套、口罩，将头发扎好，避免佩戴任何首饰。

清洁：在进入实验室之前和离开实验室时，请彻底清洁双手。正确使用消毒器械和定期对工作台进行消毒也很重要。

设备使用：在操作任何机器之前必须接受适当的培训。所有设备使用都需要注册，并且需要严格遵守操作说明。在实验之前，应对设备进行检查，以确保其正常运行并防止设备故障。在运行过程中，应时刻注意设备的状况，以检测任何异常情况。实验结束后，应对设备进行彻底清洁和检查，以防止残留有害物质和细菌的存在。

6. 人类实践

在本次人类实践中，我们深入挖掘了老年湿疹护理的临床与实际使用需求，为StaphDress表皮益生菌护肤霜研发提供全方位的需求支撑与技术指导，推动产品贴合老年湿疹患者及照护者的核心诉求，兼顾临床安全性与使用人性化。

6.1 精准化问卷星调研

我们设计并发布分患者版、照护者版的《老年湿疹患者及照护者需求调查问卷》，调研对象覆盖老年湿疹患者、患者家属、康养机构照护员、社区护工等群体，共回收有效问卷50份。问卷从基础信息、患病与护理现状、产品接受度与核心期待三大维度设题，既收集患者年龄、湿疹患病时长等背景信息，也调研现有治疗护理的痛点，还专项了解益生菌外用敷料的认知与接受度。调研显示超85%受访者愿尝试益生菌护理产品，无激素无副作用、长效止痒保湿、质地清爽易吸收、适配老年人的人性化包装成为核心期待，指导我们设计模块IV，V，从而提高患者的依从性。

图20：老年湿疹患者及照护者需求调查问卷

6.2 临床需求医院走访

联合三甲医院皮肤科、老年病科实地调研，与临床医师、护理人员及患者深度访谈。我们明确老年湿疹患者皮肤屏障脆弱、现有治疗易有耐药性或不良反应的临床痛点，以及临床对"精准抗菌+屏障修复+安全可控"一体化方案的迫切需求，为产品安全模块强化提供临床依据。

6.3 权威专家研讨指导

我们联系了学校的一位皮肤微生物学、一位临床皮肤科医生。专家针对产品设计研发、安全验证、临床转化等核心问题提出9项关键质询，具体为：

  1. 湿疹主要涉及的表皮常驻菌群有哪些，是否对应金葡菌；
  2. 为何选择表皮葡萄球菌作为载体，有什么理由；
  3. 对新的细菌引入的安全性评价，有什么证据；
  4. 修改海报，去掉一些杂乱的内容，突出核心设计与优势；
  5. 如何避免外源D-丙氨酸补偿、开关渗漏表达及突变逃逸；
  6. 如何增加工程菌在老年人干燥皮肤上的定植稳定性；
  7. 如何避免工程菌的过度增殖；
  8. 完善多靶点杀菌、脉冲式表达等方式规避突变引起的失效；
  9. 工程菌自身定植仍会对局部微生态产生温和重塑效应，是否需要避免？如何避免？

图21：与专家进行线上讨论（一）

图22：与专家进行线上讨论（二）

专家指明需完善工程菌定植可控性和安全性验证的优化方向，团队据此梳理技术要点完成方案迭代，并简化产品海报设计，突出核心优势。

6.4 专业机构联合研发

此外，我们还与咨询了皮肤微生态研究科研机构、生物制剂企业，围绕工程菌定植可控性与安全性验证展开探讨。合作方提供菌株资源、基因编辑技术、辅料优化方案等支持，协助我们验证产品核心功能模块有效性，解决工程菌定植、存活、透皮递送等技术难题，初步建立产品安全性评估体系。

综上，通过多维度调研、专家指导、机构合作与实验落地的系列实践，全面掌握老年湿疹护理的临床与实际需求，明确产品研发与优化方向，解决核心技术难题，为StaphDress表皮益生菌护肤霜的研发、临床试验与市场推广奠定坚实基础。

从实践中我们得到：一是老年湿疹护理对无激素、安全长效、人性化设计的产品需求迫切，且用户更信任专业医疗渠道的产品信息；二是临床对湿疹护理产品的抗菌、修复、安全可控一体化要求高；三是工程菌的定植稳定性与安全性是产品研发的核心关键点。我们将据此进一步完善产品设计，让产品更贴合临床与实际使用场景，兼顾安全性、有效性与实用性。

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